回应韩春雨的回应

  方舟子老师:您好。

  针对您昨天的文章,韩春雨回应了一些所谓的实验细节,见http://tieba.baidu.com/p/4645810480?pid=93027569268&cid=0&from=prin#93 027569268,想必您也看到了。

  他公布的所谓“高超的实验技巧”,包含三点:一是质疑者的细胞都污染了;二是要做银染;三是要做GFP敲入(knock-in,KI)实验证明NgAgo可以work。

  回应如下:

  一,保证实验室的细胞没有支原体污染,不是什么高超的实验技巧,而是一个正常实验室最基本的操作规范,比如每三个月定期检测支原体污染。

  二,银染并不是什么高深的实验,而是使用了几十年的常规技术,按照protocol配好buffer,把胶扔进去染色,没有人不会做。银染非常灵敏,反应速度很快,容易出现信号饱和,不适合定量,容易产生假阳性条带。韩春雨的Nature Biotechnology文章里面测试了50个位点切割基因组,每个都work,无一例外,效率最低的也有15%(补充数据图5),高的有30%(图4)。这样的效率要银染才能看到?普通的agrose胶和EB染色看不到?

  三,他的回应又建议直接做GFP的敲入,证明NgAgo可以work。这完全不合理:单个位点的切割比KI要简单,为何不先做切割,然后通过测序直接证实切割。而做GFP的敲入,通过荧光来看,难免又会有假阳性!

  还有两点:

  一是单转guide DNA引起的GFP下调的假阳性,有可能是类似RNAi的 antisense effect,看他的序列都是antisense的。

  二是重复他实验的实验室,不少是自己合成的NgAgo基因,自己已经做了密码子优化,但是仍然重复不出来。

  附韩春雨提供的实验细节:

  我目前仍只有一个做实验的小团队,无法做好服务性工作,一天十几个个电 话我都是重复的以下内容:—-所谓

  高超的技巧,其实也很简单,细胞做好检测,不要有寄生菌污染,不要有支原体污染(Ago系统对污染特别敏感—特别是单转guide假阳性—我非常确定在没有污染的情况下,单转guid不会影响GFP表达,假阴性也大多因为细胞污染,假阳性和假阴性我都遇到过,国内买的细胞我就不吐槽了),转染用的质粒质量要好(可用30ngGFP转细胞,若是均一且效率高表明质量好,强弱不均一则表明质量差,越不均一表明质量越差),guide磷酸化完全(没有磷酸化不能load和切割—谢谢印证我的Fig2结果,至于怎么检测,自己跑个PAGE看看—),特别的,对于Fig4,也是几乎惟一算是有难度的,就是控制转染时的细胞密度和用血清控制细胞生长,时间稍长,毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化—照着online method上protocol for genome editing and T7E1做(小经验,PCR最好不要有引物二聚体,如果引物二聚体多请重设引物;PCR产物直接回收最好不跑胶回收,可能跟ago切24bp有关,设好对照!)—银染分辨率高,可以排除T7E1假阳性,能做出预期条带后请用 PCR产物去测序——–欢迎大家广泛使用此系统,并分享成功经验和失败教训。附,addgen上的质粒,可以直接用作基因组编辑。再次强调,不加NgAgo,就能 抑制GFP,是假阳性,是细胞出问题了(谢天谢地不但我自己而且审稿人也有这个对照)出现假阳性的细胞切基因组就没戏了。对于Fig4,若是不习惯做银染,也可

  以直接做KI:doner 用GFPcoden+polyA signal,前后加几个保护性的碱基—从GFP-N1扩出来连到T-vector上,再从此doner-Tvector上扩(防止GFP-N1污 染的假阳性)出来纯化,500-800ng共转(for each well of 24 well plate)。

(XYS20160704)

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