中国转基因棉花研发应用二十年

  2015-09-11 基因农业网

  从1994年中国研制成功单价抗虫棉(GK),以及1995年美国保铃棉进入中国以来,抗虫棉在中国推广应用了近20年的时间。在这期间,虽然中国先后批准了7种转基因植物生产应用,但在中国转基因农作物产业化应用方面,抗虫棉仍然是一枝独秀。

  本文介绍了20多年来,中国科学家在抗虫、抗除草剂、抗旱耐盐碱、抗病、 纤维品质改良等转基因棉花研究方面所取得的进展,以及在农杆菌介导、花粉管通道、茎尖转化等不同转化技术上所进行的探索。同时,以国产抗虫棉为例,介绍了中国转基因生物安全性评价体系,概述了抗虫棉在中国的产业化历程,并对转基因棉花的研究方向作出进一步展望。

  1不同类型转基因棉花研究进展

  利用基因工程技术对棉花进行遗传改良是棉花分子设计育种的主要途径,有效地弥补了传统育种方法不能解决的问题,快速地培育出多种新型棉花育种材料。棉花遗传改良主要涉及抗逆、抗除草剂、纤维品质和早衰等重要农艺性状改良。其中,抗逆基因工程培育的抗虫转基因棉花和抗除草剂转基因棉花得到了广泛的生产应用,并取得了巨大的经济和生态效益。同时,为解决粮食增产与耕地面积不断缩小的矛盾,使棉花能够在粮食作物不能种植的干旱地和盐碱地进行栽培生产,培育具有优质、高产、耐旱耐盐碱、抗病、抗早衰等重要农艺性状的新型转基因棉花材料成为当前棉花遗传改良的研究热点。此外,适宜于南方多雨高湿地区栽培的耐涝转基因棉花等特殊用途的新材料培育也取得了一定的进展。

  1.1抗虫转基因棉花

  中国抗虫基因的研制起始于20世纪90年代初期,通过遗传转化方法使棉花获得抗虫功能的基因主要包括三类:来源于苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白基因(Bt)、从植物中分离的昆虫蛋白酶抑制剂基因和植物凝集素基因。当前,大规模生产应用的国产转基因抗虫棉主要为单价抗虫棉和双价抗虫棉,其遗传转化的抗虫基因为Bt杀虫基因GFMCry1A和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因Cpti。

  1992年,郭三堆等利用分子设计技术人工合成了具有高杀虫活性的Bt杀虫基因GFMCry1A并于1994年将该基因导入棉花,在此基础上与育种单位合作,成功选育出GK1、GK12、GK19、GKZ1和晋棉26国产单价转基因抗虫棉品种,并大面积推广应用,使中国成为继美国之后世界上第二个研制成功转基因抗虫棉的国家。之后,为了提高抗虫棉的杀虫效率、延缓棉铃虫等害虫对杀虫蛋白产生抗性,郭三堆等将2个不同杀虫机理的抗虫基因GFMCry1A和Cpti同时导入棉花,创制了双价转基因棉花新种质。通过与国内多家育种单位合作,成功选育出sGK321(1998年)、中棉所41(2001年)和中棉所45(2003年)等双价转基因抗虫棉新品种。田间抗虫性试验结果表明,2、3、4代棉铃虫平均双价抗虫棉百株幼虫数量分别比常规棉田减少81.4%、87.1%和87.0%,分别比单价抗虫棉田减少11.1%、33.3%和57.1%。双价转基因抗虫棉的研制成功,不仅在抗虫性上比单价抗虫棉优越,更重要的是丰富了抗虫棉种质资源,加速了抗虫棉新品种的培育和推广应用。

  此外,转GFMCry1A和Cpti双价转基因抗虫棉的大面积推广应用,为高效广谱抗虫棉的研制奠定了理论基础,推动了新抗虫基因的研制和应用,尤其是在抗棉铃虫和蚜虫等棉花主要害虫的防治方面取得了突破性的进展。王伟等利用根癌农杆菌介导遗传转化方法获得含有豌豆外源凝集素基因P-Lec和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因SKTI的双基因转基因棉花,对蚜虫表现出高效的抗虫性。刘志等将Cry1A和雪花莲凝集素基因GNA导入棉花,选育获得转Cry1A+GNA双基因抗虫棉花纯合株系TBG,在苗期、蕾期、开花期和结铃期主茎叶都对棉铃虫幼虫具有很高杀虫活性。同时,TBG植株在不同生育时期对棉蚜群体也表现出明显的抑制效果,其苗期和蕾期抑蚜率分别达到了50.31%和46.61%。吴家和等将入工设计合成的Cry1Ac、Bt29K和慈菇蛋白酶抑制剂基因API-B导入棉花,培育出9个抗虫性好、农艺性状优良的转基因棉品系,对棉铃虫抗性均达到90%以上。肖松华等将野生荠菜凝集素基因导入常规陆地棉品种,对9个高品质转WSA棉花株系进行抗蚜鉴定,结果表明,转基因棉花株系对棉蚜均表现出较高的抗性。张林水等将Cry1Ac3与Cpti的融合基因和GNA共转化棉花,获得了同时含有3个抗虫基因的转基因棉花新材料,该材料对棉铃虫具有较高的抗性。雒瑶瑜等将Cry1Ac与Cry2Ab导入棉花,获得了双基因抗虫棉育种材料2009002。该转基因棉花除了抗棉铃虫外,对小地老虎、刺吸类害虫、蛀食类害虫和食叶类害虫有一定的抗虫性。

  多基因共转化抗虫棉花的研制为中国后续抗虫基因的研制和应用研究开拓了新思路。通过构建多基因植物表达载体共转化不同杀虫机制的抗虫基因,或者通过基因聚合技术将多个抗虫基因聚合于一个转基因棉花材料内,培育获得含有多个基因的转基因抗虫棉。不仅可以使棉花受体获得多种机制的抗虫性,利用基因互补的方式加强转基因棉花的抗虫能力延缓害虫产生抗(耐)性,而且可以拓宽棉花抗虫谱,使其获得能够高效杀死主要害虫的广谱抗虫性。

  1.2抗旱耐盐碱转基因棉花

  中国水资源的短缺,土壤盐渍化和频繁的极端天气严重影响作物的生产,此外,在有限耕地的前提条件下,粮棉征地的矛盾日益凸显,通过研究抗逆基因提高棉花的抗逆能力,将有效地提高土地利用率,拓展可利用土地资源。近年来,中国在抗旱耐盐碱基因的研究方面取得了一些重要进展。

  1.2.1抗旱转基因棉花

  水资源的日益缺乏,全球温室效应的不断加剧,对棉花生产带来了极大挑战,因此,抗旱基因的相关研究对于提高棉花产量和加强盐碱地及干旱地的开发利用具有极其重要的意义。吕素莲将来自大肠杆菌的编码胆碱脱氢酶(CDH)基因betA导入棉花,发现该基因能够显著提高转基因棉花的抗旱和耐盐性,通过棉花苗期和蕾期的渗透(干旱)及盐胁迫试验发现来自于盐芥的TsVP可以提高转基因棉花的抗渗透(干旱)和盐能力,该工作一方面为培育抗旱、耐盐棉花新品种创造了优异材料,为中国棉花生产和大面积的盐碱地开发利用作出了力所能及的贡献;另一方面为深入了解棉花抗旱、耐盐的分子机制提供了重要资料,开辟了新的途径。

  曹燕燕等通过对rolB的功能研究,发现该基因不仅使转基因棉的茎粗明显提高,而且还使其生根能力明显增强,根/冠比显著大于对照,表现为根系更为强大,抗旱性更强。王娟对转ZmPIS棉花植株在苗期、蕾期和开花期的干旱胁迫研究表明转基因棉花的一些株系具有较强的渗透调节能力,其抗旱能力显著提高,转基因棉花植株具有较强的渗透调节能力,此外,王娟通过杂交,将来自大肠杆菌的编码胆碱脱氢酶(CDH)基因betA和来自于盐芥的TsVP聚合在一起,结果表明,转基因聚合植株与转单基因植株相比具有较高的耐旱性。吴伟在前人研究的基础上,对聚合ZmPLC1和betA的转基因聚合棉花进行耐旱性研究,结果表明,与野生型对照和转单基因对照株系相比,转基因聚合株系具有更高的干旱耐性,而且相比于野生型对照株系和转单基因对照株系,转基因聚合株系具有更高的籽棉和皮棉产量,这表明通过基因聚合手段提高植物抗逆性是可行的。杨云尧将MvP5CS和MvNHX1整合到棉花中,通过研究发现转基因株系能够提高棉花的抗旱能力。蔡永智在转基因棉花中对来源于葛兰菜的CBF1和来源于大肠杆菌的KatG进行功能研究,发现在干旱胁迫下,转CBF1和KatG棉花在光合作用、叶绿素荧光参数、生理生化以及农艺性状方面均表现出优良的生长和生理优势。说明这两个基因能通过提高抗逆能力来提高转基因棉花的产量。钱进等通过分析转MvNHX1的10个T5棉花株系在干旱胁迫后的生理指标和农艺性状,发现经干旱胁迫后转基因植株光合作用更强,根系更发达,吸收水的能力更强,农艺性状方面,转基因株系的有效铃数、有效果枝数、单铃重、皮棉、子棉和衣分等指标明显高于对照,这些株系可以作为后续遗传育种材料。

  1.2.2耐盐碱转基因棉花

  棉花是公认的耐盐、抗旱作物,克隆优良耐盐碱基因,导入棉花选育耐盐棉花品种,提高棉花对盐渍环境的适应能力,利用围垦改造的滩涂地,种植转基因耐盐碱棉花,是减轻土壤盐渍化危害以及开发利用沿海滩涂等盐渍化土地资源的重要途径之一,是缓解粮棉争地矛盾的重要策略。张慧军等将克隆自山菠菜的AhCMO导入泗棉3号棉花,盐胁迫试验结果表明,转AhCMO的棉花耐盐性显著优于对照组棉株,说明AhCMO提高了转基因棉花对盐胁迫的耐受性。大肠杆菌的betA编码的胆碱脱氢酶兼具有胆碱单氧化物酶和甜菜碱醛脱氢酶的功能。连丽君对转betA鲁棉研19的耐盐研究表明,betA的表达提高了转基因棉花叶片中甘氨酸甜菜碱的累积量,转基因棉花的耐盐能力明显提高。樊文菊对转ZmPLC1棉花和聚合ZmPLC1/betA棉花的耐盐性进行初步研究,通过水培、沙培和东营盐碱地种植,发现转ZmPLC1棉花的耐盐性高于野生型对照,转betA和ZmPLC1的聚合转基因植株,籽棉产量显著高于转ZmPLC1棉花、转betA棉花和野生型对照,以上工作表明,转ZmPLC1单个基因可以在一定程度上提高棉花的耐盐性,且聚合betA和ZmPLC12个基因后,棉花的耐盐性又进一步提高。因此,可以通过基因聚合的方法提高植物的耐盐性,为培育耐盐棉花新品种提供新的种质资源,也为研究多个耐盐基因相互作用及其调控机制提供新的试验材料。陈翠霞等利用花粉管通道技术将耐盐碱的罗布麻DNA导入鲁棉6号,从后代中筛选出棉花耐盐变异体山农011,对山农011及其杂种后代进行了抗盐遗传和基因效应分析,结果表明,变异体的耐盐性是由核基因控制的,其遗传基因效应以加性效应为主,并存在较大的加性互作效应。该耐盐变异体可作为一良好的抗盐种质材料利用。李雪林通过过表达对逆境起调控作用的转录因子基因SNAC1,系统地对转基因棉花植株进行抗逆性分析和鉴定,验证了SNAC1是具有耐旱及耐盐的转录因子基因。中国农业科学院生物技术研究所郭三堆课题组将具有自主知识产权的耐盐碱关键基因GhABF2(专利号:ZL200910158311.X)导入中国棉花主栽品种苏棉12号,创制出耐盐碱转基因棉花新品系8个,进入中间试验阶段。经过连续3年分别在山东、新疆两地进行的耐盐碱试验鉴定,获得4个综合农艺性状优良、耐盐碱性能突出的转基因棉花新品系。在0.40%―0.45%的盐碱条件下,受体棉花品种苏棉12出苗率只有32%,转GhABF2棉花新品系出苗率高达65%,单株结铃比受体增加3―4个,最终两者产量分别比其受体对照增加33%以上,具有较大的盐碱地生产应用潜力,该课题组还通过农杆菌介导棉花下胚轴遗传转化方法,将溶菌酶hel(抗病)、CP4-EPSPS(抗除草剂)和Na+/H+逆向转运蛋白基因(NhaDk3)同时导入棉花模式受体R15中,再生植物经过连续3代自交后,经抗草甘膦、抗棉花黄萎病及耐盐碱能力筛选,得到高抗棉花黄萎病、抗除草剂草甘膦及具一定耐盐碱能力的转基因棉花新品系T58-22。

  1.3抗除草剂转基因棉花

  草害是影响棉花生产的主要因素之一,棉田杂草种类严重影响棉花的生长。除草剂和抗除草剂棉花的协同使用是棉田杂草防除的重要对策。目前,抗除草剂主要有2种策略:一是引入降解除草剂的酶或酶系统,在除草剂发生作用前将其分解。二是修饰除草剂作用的靶蛋白,使其对除草剂不敏感或促使其过量表达以使作物吸收除草剂后仍能正常代谢。中国科学家针对这两种策略均做了大量研究。

  1.3.1抗草甘膦

  草甘膦是世界上使用最广泛的一种非选择性内吸传导有机膦类除草剂。其机理是竞争性抑制植株中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)的活性,阻断芳香族氨基酸的合成,造成芳香族氨基酸缺乏,导致植株死亡。国内对抗草甘膦的基因进行了大量研究,取得了很多可喜的进展。

  雷凯健等2006年从土壤总DNA中克隆到草甘膦N-乙酸转移酶基因,并对其表达蛋白的酶学特性进行了分析,为其在抗草甘膦转基因作物中的应用积累了理论依据。何鸣等通过对鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌的EPSP合成酶基因多位点突变,克隆了突变的aroA,并使之在大肠杆菌中得到表达。赵特从严重草甘膦污染的土壤中分离出一株高抗草甘膦的假单胞杆菌菌株,克隆到与EPSPS同源的G6基因,将其转化水稻进行功能验证,发现该基因具有一定的抗草甘膦活性。朱玉从长期污染草甘膦的土壤中分离到一株草甘膦高耐受性荧光假单胞菌G2菌株,从中克隆到的epsps不含国外公司专利保护的保守序列和突变位点,显示了良好的开发应用潜力。沙纪莹从斯氏假单胞菌基因组文库中克隆到一个完整的基因,能在草甘膦浓度为150mmol・L-1的M9液体培养基中良好生长,该基因有望成为培育高抗草甘膦转基因作物的基因材料。刘柱从被草甘膦极度污染的土壤中分离到一株极端抗草甘膦菌HTG7,该菌株能在草甘膦浓度为900mmol・L-1的Mops限制性培养基上生长。从中克隆到全长1350bp、编码EPSP合酶的基因。该EPSP合酶基因与之前报道的aroA在核苷酸水平几乎没有任何同源性,蛋白序列与22种已报道的微生物来源的EPSP合酶的同源性也在46%以下。并通过错误倾向PCR方法,找到了该EPSP合酶的关键活性位点,为培育具有中国自主产权的转基因抗草甘膦作物提供的基因资源。童旭宏等从陆地棉中克隆到EPSPS,对该基因进行了组织特异性表达分析,为抗草甘膦棉花种质资源的创制提供了理论基础。程海刚等从棉田间的杂草青麻中克隆到epsps,通过转化酵母证明所获得的epsps具有生物学功能。之后,中国农业科学院生物技术研究所郭三堆课题组将该基因转化棉花,筛选出具有良好草甘膦抗性的棉花植株。此外郭三堆课题组还和中国农业科学院生物技术研究所林敏课题组合作,将林敏课题组从极端抗草甘膦微生物中克隆到的抗草甘膦新型EPSP合酶GR79及N-乙酰转移酶GAT进行了密码子改造和基因结构优化,通过转化烟草和棉花,初步验证了抗草甘膦基因的抗性,并获得了对草甘膦有较强抗性的双价抗草甘膦转基因棉花材料。

  1.3.2抗其他除草剂

  除草剂2,4-D类似植物生长素,前人从土壤细菌Alcaligeneeutrophus分离到tfda,该基因编码的2,4-D单氧化酶能将2,4-D降解为2,4-二氧苯酚,其降解产物对植物的毒性比2,4-D小100倍,山西省棉花研究所陈志贤等与澳大利亚CSIRO及中国农业科学院生物技术中心合作,将tfda导入晋棉7号、冀合321等棉花品种,对其后代进行田间抗药性鉴定表明转基因系对2,4-D的耐受性超过了大田使用浓度。中国农业科学院棉花研究所与中国科学院上海植物生理研究所合作,将除草剂草丁膦的bar导入棉花主栽品种,取得了阶段性成果。张磊通过精细定位,从水稻中克隆到bel,该基因可对苯达松和磺酰脲类除草剂产生抗性。溴苯腈是除草剂buctril的活性成分,其作用机理是抑制光合作用的电子传递。张金文等2006年从克雷伯氏臭鼻杆菌中克隆到编码腈水解酶基因bxn,通过在大肠杆菌中表达,证明其可将溴苯腈降解为无毒物质。乙酰乳酸合成酶(ALS,EC2.2.1.6) 在细菌、酵母和植物中催化支链氨基酸的生物合成,它是磺酰脲类除草剂的作用靶标。宋贵生等2007年从水稻中克隆了als,转化烟草后发现转基因植株和对照烟草相比其除草剂抗性高达50mg・L-1。卢宗志等2009年从杂草雨久花中克隆到als,研究表明抗药性雨久花对除草剂苄嘧磺的抗性可能与其第197位的突变相关。

  1.4抗病转基因棉花

  棉花病害是影响棉花生产的主要因素之一,目前困扰中国棉花产业的主要病害是黄萎病,棉花黄萎病是黄萎病菌经土壤传播、侵染到棉花植株最终引发维管束疾病的一种真菌性病害,具有危害严重、分布范围大、寄主种类多及存活时间长等特点,可造成棉花大量减产甚至绝收,被形象地称为棉花的“癌症”。针对以黄萎病为代表的主要病害,采用传统的防治手段,如通过传统育种的方法培育抗病品种、农药防治等方法收效甚微,而且存在培育周期长,严重污染环境等问题,因此,近年来中国研究人员从生物技术的角度,对抗棉花黄萎病基因开展了大量的研究,并取得了重要进展。

  高巍以海岛棉品种海7124作为研究材料,通过比较蛋白质组学的方法,一共得到188个在海7124根系中受黄萎病菌侵染后与水处理的平行对照相比表达量出现差异的蛋白,这些蛋白共同参与了棉花对黄萎病菌入侵的响应。徐理分别构建了抗黄萎病的海岛棉海7124接种黄萎病菌后的抑制差减杂交cDNA文库以及通过大规模测序的RNA-Seq技术研究棉花抗黄萎病机制,通过基因表达分析,获得了大批棉花抗黄萎病相关基因,并对其中的一个WRKY类转录因子进行了较为详细的功能。孟宪鹏克隆得到2个海岛棉ERF转录因子基因,将其转化植物后对其抗病相关功能进行研究,结果表明,在转基因烟草中,海岛棉ERF转录因子可以增强烟草PR基因的表达;在转基因棉花中,可以增强几丁质酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因和PR基因等棉花抗病相关基因的表达。由此推测,将海岛棉ERF基因转入棉花超表达后能够高效激活下游抗病相关基因的表达。通过对已得到的转基因棉花部分幼苗进行黄萎病菌侵染后发现:T0转EREB1棉花幼苗的耐病能力高于对照。通过上述研究可知:海岛棉ERF族基因的新成员EREB1/2在调控抗病相关基因表达方面具有重要作用,EREB1/2在转基因烟草和棉花中超表达后可有效增强植株体内抗病相关基因的表达,从而提高了转基因植株的抗病能力。张文蔚以陆地棉高抗黄萎病新品系中植棉KV1为材料,接种大丽轮枝菌强致病力落叶型菌株V991后0―96h棉株幼根总RNA,构建正、反向抑制差减杂交文库,筛选到147个信号强度差异明显的克隆,建立了黄萎病菌侵染初期陆地棉的抗病相关基因表达谱,并证明了GhUbI1、GhEG和GhSCF在陆地棉抗黄萎病的过程中起重要作用。赵付安采用SSH技术从转录组水平探讨了陆地棉基因的差异表达,采用2-DE技术从蛋白质组水平探讨了栽培棉近缘野生种瑟伯氏棉的蛋白差异表达,并以此为基础克隆了2个陆地棉结构抗性基因GhDIR和GhSUMO,克隆了瑟伯氏棉根的GPIP,克隆了瑟伯氏棉根的4个TIR-NBS-LRR类抗病基因类似物,这七个基因的克隆为进一步研究其抗病功能奠定了基础。倪萌等采用叶片针刺接种法从细胞学方面分析转hpa1xoo棉花与棉花黄萎病菌互作产生的微过敏抗病反应,通过细胞显微观察表明,转hpa1xoo棉花T-34与非转基因棉花在抗病性表型方面存在明显差异,转hpa1xoo棉花较非转基因棉花有较强的抗病性。

  1.5纤维品质改良转基因棉花

  棉纤维是棉花产量形成的主要部分,其品质决定经济价值。在生产实践中,高产棉花不优质、优质棉花不高产是限制棉花种植业发展的主要因素之一。随着纺织工业的不断发展,对棉花纤维品质不断提出新的要求,传统的遗传育种技术已经不能解决生产实践中关于棉花产量和品质之间存在的矛盾。利用基因工程技术将棉花纤维发育相关基因导入棉花,提高棉花纤维产量和品质,成为当前棉花增产和品质改良的主要途径。同时,随着高通量基因克隆和表达分析技术的不断发展,大量与棉花纤维产量和品质相关基因和表达调控元件得到了验证,并初步应用于棉花。

  据报道,棉花纤维增产基因主要与棉花种子发育和IAA等激素代谢相关。李德谋等将GhASN-Like导入棉花,提高了转基因植株的单株成铃数和单铃种子数,增加了籽棉和皮棉的产量。裴炎等利用棉花纤维细胞特异启动子FBP7,驱动IAA合成基因iaaM在棉花中表达。使在棉纤维发育起始阶段,胚珠表面的IAA含量迅速增高,增加了能够发育成纤维的细胞数量。经过连续4年测产,转基因棉花纤维产量比对照提高了15%以上。

  棉花纤维品质与纺织工业的应用密切相关,主要涉及了棉纤维长度、细度、强度、色泽等指标。目前,利用基因工程技术将调控棉花纤维发育的相关基因导入棉花来提高棉花纤维品质,已经取得了初步的进展。李文彬等利用棉花纤维特异启动子驱动吲哚双加氧酶(bec)基因在棉花中表达,使转基因棉花纤维获得了特殊的颜色。左开井等将GbAnn9导入棉花,转基因棉花纤维长度比对照材料增加2―3.5mm,纤维强度增加0.3―3.3CN/tex。夏桂先等将棉花苯丙烷类化合物木质素合成基因GhLIN2导入棉花,增加转基因棉花纤维内木质素含量,使棉花纤维长度、细度和强度均得到显著提高。李晓荣等利用35S启动子驱动棉花尿甘二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因GhUGP1在棉花中表达,获得的转基因棉花材料纤维长度比对照增加18.5%,断裂比强度增加31.85%。

  此外,通过对棉花纤维细胞发育机理的简析,分离获得了多个与棉花纤维品质相关的候选基因。刘进元等克隆获得棉花纤维可逆糖基化蛋白酶基因,该基因可以通过控制棉纤维中多糖物质的积累,进一步提高棉纤维的品质。李学宝等克隆获得棉花纤维特异表达的水孔蛋白家族基因GhPIP2;6,其转录产物主要在伸长期的棉花纤维中高表达,通过在酵母中表达研究发现可以使细胞长度增加1.3―1.47倍。朱玉贤等克隆获得与棉花纤维伸长密切相关的β微管蛋白基因,该基因在棉花纤维伸长期高表达与棉纤维长度发育密切相关。

  为了能够实现棉花纤维发育相关基因的精确定位表达,在棉纤维特异表达启动子方面的研究也取得了重要的进展。郭三堆等分离获得了一个在棉花生殖器官优势表达的启动子Arf1,该启动子为棉花腺苷酸核糖基化作用因子基因的启动子。与报告基因GUS融合后,利用花粉管通道法转化棉花,报告基因在转基因棉花的生殖器官高表达。张献龙等克隆获得了棉花纤维特高效表达的类成束蛋白样阿拉伯半乳聚糖蛋白基因(GhFLA1)启动子,该启动子能够驱动GUS报告基因在棉花纤维发育0―20d高表达。

  1.6其他性状如早衰、耐涝以及特殊用途等转基因棉花

  目前,生产应用的高产、优质棉花品种均具有早衰的特征,限制了高产、优质棉花品种的推广应用。利用基因工程技术延缓棉花的生长发育过程中的早衰现象,对具有早衰特性的棉花高产品种的培育和推广应用具有重要意义。李静等克隆获得了异戊烯基转移酶基因ipt,该基因编码的蛋白是细胞分裂素生物合成途径中的关键酶。将该基因导入早衰型陆地棉品种中棉所10号中,通过对转基因棉花进行叶绿素和细胞分裂素含量的测定及形态观察,发现转基因棉花的早衰性状得到延迟。

  在中国南方湿度大或者雨水多的地方,由于棉花不耐湿和涝的特性,雨季来临时会引起棉花大量落铃导致减产,限制了棉花种植业的发展。利用基因工程技术将耐涝基因导入棉花,培育耐涝棉花新材料,不仅可以保证棉花稳产高产,而且可以通过将其他地区不耐涝的棉花培育为耐涝材料,为遗传育种提供更加丰富的资源材料。中国农业科学院生物技术研究所作物分子育种课题组将来源于透明颤菌血红蛋白基因(vgb)经过密码子优化设计后导入棉花,培育出高耐涝的转基因棉花新材料,该材料在地下部分封闭的涝池内表现良好,比对照材料增产20%以上。

  上述不同类型转基因棉花的获得,极大地丰富了中国的棉花种质资源,促进了中国棉花的育种研究。

  2棉花的遗传转化方法

  遗传转化方法是进行基因功能分析和改良作物性状的必要手段。主要的植物遗传转化技术可分为两大类:第一类是直接基因转移技术,包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等,以基因枪转化法和花粉管通道法为代表。第二类是生物介导的转化方法,主要有农杆菌介导和病毒介导等转化方法,其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高,广泛应用于单、双子叶植物的遗传转化。随着科学技术的不断发展,近年来,逐渐发展了一些新的转化技术,如茎尖或芽尖转化法,农杆菌菌液浸染法以及纳米载体花粉介导法等。这些转化方法的兴起及广泛应用对转基因育种具有重要意义,极大地加快了农作物改良以及新品种选育的步伐。

  3转基因植物安全性评价

  一系列具有优良性状(如抗虫、抗除草剂等)的转基因作物新品种的大面积推广种植在带来直接经济与生态效益的同时,也为解决未来世界粮食、能源危机提供了新的途径。但同时,转基因技术也存在一定的风险。近年来,转基因生物安全问题在全世界范围内引起了广泛关注。目前对转基因植物的安全性评价主要集中在2个方面,一是环境安全性,另一是食品安全性。

  3.1转基因植物的环境安全性

  转基因植物的环境安全性主要涉及3个方面:(1)转基因植物本身可能演变为农田杂草。植物在获得某种特定基因(如抗病、抗虫、抗除草剂和抗逆等),可能会增强其生存竞争性,在生长势、越冬性、耐受性、种子产量等方面强于非转基因植物。若被推广种植,释放到自然环境中的机会特别大。因其具有野生植物没有的各种抗性,将会迅速地成为新的优势种群,进而演变成农田杂草。(2)基因漂流影响其他物种。在自然条件下,栽培作物和栽培作物之间、栽培作物与其近缘野生种之间、栽培作物和杂草之间都可能存在种间基因漂流能力。因此,转基因植物中的一些抗除草剂、杀虫剂和病毒的抗性基因就有可能通过花粉杂交等途径向其同种或近缘野生种转移,从而产生出一些可抗除草剂、杀虫剂和病毒的“超级杂草”,造成不可估量的农业损失和生态灾难。(3)影响生物的多样性。植物在引入抗虫或抗病基因后,往往具有较强的“选择优势”,大量的转基因植物进入自然生态系统中,可能会淘汰原来栖息地上的物种及其他遗传资源,加剧品种的单一化,造成生物数量剧减,甚至会使原有物种灭绝。如转入BT杀虫基因的抗虫棉,其目标昆虫是棉铃虫和红铃虫等植物害虫,如大面积和长期种植抗虫棉,昆虫有可能对抗虫棉产生适应性或抗性,这会影响抗虫棉的应用和BT农药制剂的防虫效果。因此,在抗虫棉推广时一般要求种植一定比例的非抗虫棉,以延缓昆虫产生抗性。(4)可能对非目标生物造成危害,在植物基因工程中所用的许多基因是与抗虫或抗病有关的,其直接作用的对象是生物。其插入的抗虫或抗真菌的基因可能对其他非目标生物起作用,从而杀死了环境中有益的昆虫和真菌。美国康奈尔大学Losey等发现,转基因Bt玉米花粉能导致非目标害虫黑麦金斑蝶(DanausplexippusL.)幼虫死亡。

  3.2转基因植物的食品安全性

  转基因食品又称基因修饰食品,即用转基因生物制造或产生的食品。进行转基因食品安全评价时,应从宿主、载体、插入基因、重组DNA、基因表达产物及其对食品营养成分的影响等方面来考虑。评价内容主要包括4个部分,第一部分是基本情况:包括供体与受体生物的食用安全情况、基因操作、引入或修饰性状和特性的叙述、实际插入或删除序列的资料、目的基因与载体构建的图谱及其安全性、载体中插入区域各片段的资料、转基因方法、插入序列表达的资料等;第二部分是营养学评价:包括主要营养成分和抗营养因子的分析;第三部分是毒理学评价:包括急性毒性试验、亚慢性毒性试验等;第四部分是过敏性评价,主要依据联合国粮农组织与世界卫生组织提出的过敏源评价决策树依次评价,禁止转入已知过敏源。

  中国农业科学院生物技术研究所与江苏省农业科学院经济作物研究所、山西省运城棉花研究所、石家庄市农业科学院、中国农业科学院棉花研究所等多家育种单位合作,将构建成功的含有自主知识产权的抗虫基因植物表达载体采用花粉管通道技术和农杆菌介导法进行遗传转化,经过后代分子鉴定、室内生测后,育成了一批转基因抗虫棉品种,为以后国内转基因抗虫棉品种的培育提供了特异的种质资源,也为国内抗虫棉的迅猛发展提供了动力。

  为了加强农业转基因生物安全管理,保障人类健康和动植物、微生物安全,保护生态环境,促进农业转基因生物技术研究,农业部陆续出台了多个条例、办法和公告,来规范转基因抗虫棉的田间释放和产业化。

  自1996年开始转基因抗虫棉安全性评价申报以来,至2013年共计申报并通过生产应用的安全性评价2016份,从图1中可以看出,随着安全性评价内容的完善、管理规范化,从2004年农业部简化了转基因抗虫棉安全评价的申报程序以后,获得的安全证书的数量急剧上升,基本上每年审批的证书数量都在150份以上(图1)。

  拥有中国基因知识产权的转基因抗虫棉安全性评价共计1955份,其中,转Cry1Ab/cry1Ac棉花1391份,占总安全性评价2016份的69.00%,转Cry1Ab/cry1Ac+CpTI棉花553份,占27.40%,转Cry1Ac+API棉花11份,占0.55%; 美国孟山都公司申请并通过转cry1Ac抗虫棉安全评价61份,占3.05%。

  总之,自1996年国产抗虫棉进入田间试验,各省棉花育种相关单位利用抗虫棉种质资源开始大规模以来,中国抗虫棉的研究及产业化取得了迅速的发展,国产抗虫棉的种植面积逐渐增加。国产转基因抗虫棉的应用经历了近20年的风风雨雨,为中国棉花产业的发展和改善生态环境作出了巨大贡献。而中国转基因抗虫棉安全性评价为转基因抗虫棉的生产应用起到了保驾护航的作用。

  目前,转基因作物的安全性评价技术与政策保障体系已经建立,今后还应该加大转基因棉花安全生产应用保驾护航作用的力度,大力发展中国转基因植物分子育种高新技术,为迅速占领高新技术制高点、提高中国转基因植物分子育种的国际竞争力再作新贡献。

  4转基因抗虫棉的品种培育及推广

  4.1抗虫棉品种审定情况

  中国审定的第一个转基因抗虫棉品种是美国岱字棉公司的新棉33B,该品种于1997年由河北省审定,审定编号为冀审棉97001号,1997―2006年美国岱字棉公司与孟山都公司先后在河北省、河南省、山东省、安徽省、湖北省和湖南省审定了7个转基因抗虫棉品种,在2003年以前无论从品种数量还是种植面积都占抗虫棉的统治地位。中国从1998年开始审定了第一批转单价抗虫基因国产转基因抗虫棉品种,如:GK12、晋棉26和GKZ1(国抗杂一号),1999年审定了第一个国审抗虫棉品种中棉所38,从此迈开了中国转基因棉花品种培育和生产推广的步伐。截至到2013年,中国共通过了134个国审转基因抗虫棉品种,黄河流域审定96个,长江流域审定36个,西北内陆棉区审定了2个,其中以生产需求量最大的中熟品种为主,有生育期少于110d的早熟品种7个,彩色棉品种1个。目前,中国抗虫棉已经形成了覆盖所有棉区、不同熟期不同类型搭配合理、常规棉与杂交棉并重的品种体系。

  4.2抗虫棉品种发展的趋势及存在的问题

  4.2.1杂交品种比例越来越大

  1999―2013年,134个国审品种中有88个杂交品种,2006年以前只有23个杂交品种,2007―2013年共审定了65个杂交品种。其中,长江流域36个品种中只有1个常规品种,杂交品种有35个,从以上的数据可以看出,黄河流域棉区以常规种和杂交种并重,长江流域棉区以杂交种为主。4.2.2品种存在多、乱、杂现象1996―2012年,转基因抗虫棉的品种数量在逐年增加,截至到2012年,内陆棉区种植面积超过0.33万公顷的棉花品种品系一共有245个,其中黄河流域有166个,长江流域品种有79个,这里面有国审、省审品种,还有些没有审定的品系。品种的多样性满足了不同中国气候类型耕作制度的需求,但同时也存在品种同质化品种多,突破性品种少的问题。因此造成了有些抗虫棉品种审定后没有推广几年就被淘汰的现象,品种更替过于频繁,造成人力物力的浪费。

  4.2.3品种的产量性状不断提升,但纤维品质性状改进不大

  随着抗虫棉品种的发展,棉花单产不断提高,在中国棉花面积没有增加的情况下,产量有了大幅度提高。但是与纤维品质相关的性状改进不明显,特别是棉纤维的长度和比强满足不了今后棉花机采作业和纺织行业技术更新的需求。有待今后抗虫棉育种单位进行选育方向的调整。

  4.3转基因抗虫棉的产业化

  4.3.1抗虫棉的推广面积

  从1997年转基因抗虫棉开始大面积种植,主要是以美国的品种为主,当时占国内抗虫棉市场份额的95%以上,国产抗虫棉份额不到5%。随着中国自主研发的转基因抗虫棉逐渐成熟,国产抗虫棉的品种数量和种植面积逐年提高,2001年转基因抗虫棉的面积首次超过了非转基因棉面积。之后国产抗虫棉的数量和推广面积都迅猛增长,2002年国产抗虫棉占国内抗虫棉市场份额的43.3%,2003年国产抗虫棉的面积超过了美国抗虫棉面积,占国内抗虫棉市场份额的53.9%,到2007 年,国产抗虫棉面积已占96.1%,1998―2013年国产抗虫棉累计推广面积超过3000万公顷,打破了美国抗虫棉的垄断,成功地保护了中国棉花产业及相关产业和民族利益。

  4.3.2抗虫棉产业化对中国棉种行业产生了深远的影响

  抗虫棉在中国市场零售价为37.2元/kg,改变了非抗虫棉种8.2元/kg的低价局面,为提升棉种质量,改进棉种生产和销售方式提供了可能。由于棉种利润的增加,催生了一批专业从事棉种或以棉种为主营业务育繁推一体化的公司。在抗虫棉的品种选育方面也逐渐由科研单位、大专院校为主向育繁推一体化的种业公司和民营研究所转变。使得抗虫棉品种的选育更贴近市场的需求,加快了品种选育和推广的步伐,使中国棉种行业走上了一条良性循环的道路。

  随着国产抗虫棉研制技术的成熟,中国抗虫棉优良的抗虫性和突出的综合性状引起了世界上各产棉国的关注。中国先后与印度、澳大利亚和巴基斯坦签订了抗虫棉的合作项目,目前,项目正在进行中。国产抗虫棉已经走出国门,迈向世界,参与了国际竞争。

  5中国转基因棉花研究方向的展望

  如上所述,随着转基因抗虫棉的品种类型日渐丰富、允许安全应用的区域逐步放开,近年来,转基因抗虫棉的产业化有了长足的发展,取得了良好的经济和社会效益。但是,在研究方面,仍然存在一些亟待解决的问题,也是中国转基因棉花的未来研究方向。

  5.1运用多个抗虫基因提高棉花的综合抗虫能力

  抗虫棉从开始应用到现在已经近20年的时间。长期种植转基因单价、双价抗虫棉,虽有效防治了棉铃虫的发生,但由于农药施用量大大减少,一些次要害虫,如盲蝽象、蚜虫等的危害日益突出,上升成为棉花主要害虫;同时,抗虫棉本身也存在生长发育后期抗虫性下降、可能发生抗性棉铃虫等综合问题,所以需要加大力度寻找新型有效的抗虫基因资源,研发转新型双基因、多基因的抗虫棉,以提高转基因抗虫棉的综合抗虫能力。

  5.2培育自主产权的抗除草剂棉花

  随着农村劳动力向城市转移以及农业可持续发展的需要,全生育期利用除草剂防除杂草成为机械化植棉的重要需求。针对不同棉区的杂草种群类型和除草剂使用偏好,尤其针对高效、低毒、低残留的除草剂类型,积极筛选新的有利用价值的抗除草剂基因,研发具有中国自主知识产权的抗除草剂棉花。

  5.3培育耐旱耐盐碱转基因棉花

  中国人多地少是无法解决的刚性难题,要满足棉花原料的供应问题,利用中国现有的2000多万公顷的干旱、盐碱地,将其转变成棉田,扩大植棉面积、增加原棉总量是解决棉花原料供应问题的重要途径。伴随着植物耐逆分子通路的解析和对极端生境微生物(如盐湖微生物等耐逆机理)的研究,耐旱、耐盐碱的基因资源正在逐步被挖掘和应用于转基因棉花育种。

  5.4培育抗病转基因棉花

  枯、黄萎病一直是影响中国棉花生产的主要病害。随着对枯、黄萎病遗传规律和抗性机理的进一步揭示,以及抗性相关基因QTL定位和基因克隆,为转基因抗病棉花育种提供了抗性基因资源。同时,由于致病生理小种的复杂性,还需广泛搜集和挖掘利用野生棉及棉属近缘物种中高抗枯、黄萎病的基因,并将分子标记育种、转基因育种与常规育种相结合,利用综合育种技术聚合多种抗性基因,加快棉花抗病育种的进程,培育出高抗病的转基因棉花新品种。

  5.5培育优质转基因棉花

  受国际市场的影响,棉纺工业正处在一个由低端产品向中高端产品过渡的转型期。而要提高中国棉纺企业的国际竞争力,首当其冲的就是要解决优质棉原料的供应问题。因此,满足纺织企业需求的优质棉生产必将成为中国棉花生产发展的主要方向。随着棉花功能基因组学研究的发展,棉纤维的发生、发育机制正在逐步明晰,一批对棉纤维的品质起决定作用的基因正在被挖掘和应用于转基因优质棉花的培育。

  现代棉花种植方式对棉花品种的要求更加多样,运用转基因生物育种技术,改善棉花的抗虫、抗除草剂、耐逆、抗病和优质等性状,并让这些有利于棉花生产的性状在较短的时间内聚合,才能满足今后棉花生产的需要。因此,综合利用转基因植物生物育种技术,培育高产、优质、抗逆的突破性新品种,是中国转基因棉花育种发展的根本。

  总之,中国转基因棉花20多年来取得了骄人的成绩。特别是国产转基因抗虫棉的研发和产业化的成功,不仅促进了中国棉花及相关产业的发展,打破了美国的垄断,提升了国际竞争力,它推广应用的速度之快,影响力之广,所产生的经济社会效益和生态效益之大,创造了中国近代农业科学发展史上的奇迹。(作者:郭三堆、王远、孙国清、金石桥、周焘、孟志刚、张锐,有删节)
  来源:中国农业科学

(XYS20150913)

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